Sanger

Vous souhaitez :

  • Connaitre les prédispositions génétiques de votre animal de compagnie à certaines maladies
  • Confirmer la couleur de robe de votre poulain ou vérifier la présence ou l'absence de cornes sur vos veaux dans le cadre d'une amélioration de race
  • Vérifier la présence d'un insert dans un plasmide
  • Chercher la présence de mutations impliquées dans les mécanismes de résistances aux antibiotiques ou antifongiques chez des micro-organismes
  • Déterminer la séquence d'un ou plusieurs gènes cibles pour des études de filiation ou de génotypage
  • Réaliser une sauvegarde de la séquence d'un anticorps présentant un intérêt pharmaceutique...

Le séquençage par la méthode Sanger qui permet de déterminer l’enchaînement des bases d'une séquence courte d'ADN est une des techniques couramment utilisées pour répondre à ces besoins.

Technicien réalisant un séquençage
Principe de la méthode

Cette technique de séquençage de l'ADN, également appelée "séquençage par terminaison de chaine" ou "séquençage déoxy", a été développée par le biochimiste Frederick SANGER en 1977 et comporte deux étapes :

  1. Une PCR spécifique : elle diffère d’une PCR classique par l'utilisation d'une seule amorce (au lieu de deux) et par l'incorporation de nucléotides chimiquement modifiés bloquant l'élongation du fragment, les didéoxynucléotides (ddNTPs). La présence d'une seule amorce empêche l'amplification du fragment à séquencer. Les ddNTPs, quant à eux, permettent d'obtenir des fragments de longueurs différentes. Les concentrations en ddNTPs utilisées permettent statistiquement de synthétiser toutes les longueurs de fragments. Dans la méthode de base, 4 réactions étaient réalisées simultanément, chacune comprenant un ddNTP particulier (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP). De nos jours, chacun des 4 ddNTPs est porteur d'un fluorochrome spécifique, ce qui permet un marquage des fragments d'ADN à leurs extrémités lors d'une réaction unique.
  2. Une séparation des fragments : dans la méthode originelle, les produits de chaque réaction étaient séparés par électrophorèse sur une piste définie d'un gel d'agarose. Les fragments étant séparés suivant leur longueur, il suffisait de "lire" les bandes présentes sur le gel pour déterminer la séquence. De nos jours, les fragments d'ADN obtenus sont soumis à une électrophorèse capillaire durant laquelle le signal fluorescent émis par chaque ddNTP marqué est analysé par informatique. Le traitement des données permet ainsi de déterminer l'identité du nucléotide et de reconstituer la séquence de la matrice d'ADN d'origine.
Principe du séquençage Sanger

Profil de migration après électrophorèse capillaire

Exemple de chromatogramme Sanger
Présentation du SeqStudio d'Applied Biosystems

Biomnigene est équipée pour la réalisation de vos réactions de séquençage, d'un appareil SeqStudio (Applied Biosystems).

Vos échantillons peuvent nous être fournis sous différents formats (plaques PCR ou tubes). Pour une qualité optimale des séquences, un contrôle qualité de vos échantillons est réalisé.

Le séquençage est réalisé sous 72 h et les données cryptées vous sont fournies en format .ab1 et/ou en format FASTA (fichier texte) par e-mail.

Pour les matrices complexes telles que les fragments d'ADN riches en bases G/C, nous proposons un protocole adapté réduisant les formations de structures secondaires inhibitrices de la réaction de PCR.

Echantillons et séquences sont conservés dans nos locaux pendant une durée de 2 mois, sauf indication contraire de votre part.

Vous êtes intéressé par nos solutions ?

La biologie moléculaire appliquée à vos besoins.


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