PCR

Préparation d'un mix pour PCR

Vous souhaitez :

  • déterminer une séquence pour identifier des mutations (mutations ponctuelles (SNPs), insertions, délétions)
  • évaluer les liens de parenté entre individus ou populations
  • mettre en évidence la présence d'un organisme donné dans un échantillon biologique
  • réaliser un clonage dans un vecteur d'expression pour la synthèse d'une protéine recombinante...

Ces analyses requièrent généralement une amplification de matériel génétique par une réaction enzymatique appelée PCR (Polymerase Chain Reaction). Cette réaction est généralement réalisée à partir d'ADN. Pour certaines applications spécifiques, on utilise comme matériel de départ de l'ADNc obtenu par transcription inverse d'ARN.

Principe de la méthode

Les molécules d'ADN, dans leur état naturel, sont constituées de deux brins complémentaires. Le passage à une température supérieure à 94 °C entraîne la séparation des deux brins de l'ADN et la destruction des structures secondaires (étape de dénaturation).

Les molécules d'ADN simple brin sont ensuite appariées à leurs extrémités à des fragments de petite taille appelés amorces lors de l'étape d'hybridation se déroulant à une température voisine de 54 °C (dépendante de la composition de l'amorce).

Lors de l'étape d'élongation, une enzyme appelée ADN polymérase fonctionnant de manière optimale à 72 °C, vient allonger ces amorces pour former les brins complémentaires aux matrices d'origine générant ainsi deux molécules double brins identiques à la molécule de départ.

Un nouveau cycle (dénaturation - hybridation - élongation) peut alors débuter.

La réaction PCR est constituée de N cycles (généralement compris entre 30 et 40) conduisant à la synthèse de 2 puissance N copies de la matrice d'origine.

Déroulement d'une PCR
Thermocycleurs X50S en cours de cycle de PCR

Pour obtenir les meilleurs résultats, les PCR sont réalisées à l'aide de réactifs (enzymes, tampons, ...) adaptés à vos besoins.

Par exemple, pour les problématiques demandant de connaître de manière précise la séquence en nucléotides telles que la recherche de SNP (single nucleotide polymorphisme) ou de mutations spontanées, nous utiliserons une polymérase haute fidélité.

Pour les problématiques reposant sur la taille des fragments amplifiés, l'utilisation d'une polymérase classique est suffisante.

Il existe également des solutions spécifiquement dédiées à l'amplification difficile de fragments riches en bases G/T et G/C. Le programme (températures, durées des étapes et nombre de cycle) et la composition du mélange réactionnel sont ajustés en fonction de la taille et de la composition en bases de la matrice d'ADN et des amorces.

Chez BIOMNIGENE, les PCRs sont réalisées sur thermocycleurs Mastercycler X50s (Eppendorf). Ces appareils sont équipés d'un système qui permet de tester un nombre inégalable de températures et ainsi, de déterminer rapidement les conditions optimales pour l'amplification de vos fragments.

Sur demande, nous réalisons la purification de vos produits PCR. La concentration et la qualité de vos amplicons pourra également être évaluée par mesure de l'absorption dans l'UV à l'aide d'un spectrophotomètre micro volume, ou par dosage fluorimétrique sur Qubit.

Un rapport contenant les conditions d'amplification, concentrations, pureté relative de vos amplicons vous sera fourni.

Le matériel génétique amplifié peut vous être retourné par transporteur ou être utilisé par nos soins pour des manipulations ultérieures (analyse de fragments, clonage, séquençage).

Thermocycleurs Eppendorf X50S en attente

Vous êtes intéressé par nos solutions ?

La biologie moléculaire appliquée à vos besoins.


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